konstanta michaelis

V.        HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Enzim merupakan biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis ( senyawa yang dapat mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia organic. Enzim bekerja dengan cara bereaksi dengan molekul substrat untuk menghasilkan senayawa intermediet melalui suatu reaksi kimia organic yang membutuhkan energy aktivasi lebih rendah sehingga reaksi kimia mengalami percepatan reaksi.

Kerja dari suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa factor diantaranya adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan inhibitor. Suhu dan pH yang terlalu ekstrim ( diluar kondisi optimum), enzim akan mengalami perubahan bentuk karena denaturasi. Hal tersebut akan menyebabkan enzim kehilangan fungsinya. Selain dengan suhu dan pH, kerja enzim juga dipengaruhi oleh kandungan substratnya. Namun hubungan antara substrat dan enzim hanya terjadi pada bagian tertentu. Tempat atau bagian enzim yang mengadakan hubungan atau kontak dengan substrat disebut dengan bagian aktif ( active site ). Bagian aktif atau sisi aktif sering disebut juga dengan nama sisi katalitik atau sisi pengikatan substrat. Hubungan antara enzim dengan substratnya terbagi menjadi dua model yaitu:

1.      Moel kunci dan gembok ( Lock And Key )

2.      Model Induced- fit.

Enzim berdasarkan jenisnya terbagi menjadi 6 golongan yaitu:

1.      Oksidoreduktase

2.      Transferase

3.      Hidrolase

4.      Liase

5.      Isomerase

6.      Ligase

Michaelis dan Menten berkesimpulan bahwa kecepatan reaksi tergantung pada konsentrasi kompleks enzim-substrat (ES), sebab apabila tergantung pada konsentrasi substrat (s), maka penambahan kecepatan reaksi apabila digambarkan akan merupakan garis lurus. Sehingga reaksi dengan enzim ditulis sebagai berikut:

K1       = tetapan kecepatan reaksi pembentukan kompleks ES

K2       =  tetapan (konstanta) kecepatan reaksi pembentukan kembali E dan S

K3         = tetapan (konstanta) kecepatan reaksi penguraian kompleks ES menjadi enzim dan hasil reaksi

Pada praktikum kali ini, akan dilakukan penentuan konstanta Michaelis pada hidrolisis sukrosa oleh - fruktofuranosidase dari yeast.

Oligosakarida merupakan gula dengan 3 hingga 20 unit sakarida. Oligosakarida merupakan rantai pendek polisakarida ( Manning et al. 2004 ). Karakteristik senyawa oligosakarida menurut Manning dan Gibson ( 2004) adalah sebagai berikut:

1.      Tersusun atas dua monosakarida.

2.      Memiliki ikatan glikosidik.

3.      Memiliki berat molekul yag lebih rendah dibandingkan dengan polisakarida.

Sukrosa merupakan salah satu jenis oligosakarida. Sukrosa merupakan gula meja yang pada umumnya dihasilkan oleh tumbuhan terutama pada tumbuhan tebu. Sukrosa apabila dihidrolisis maka akan menghasilkan α-Glukosa dan β-Fruktosa. Berikut adalah gambar struktur dari sukrosa:

Sukrosa mengalami invertase dari α–D-glukosida glukohidrolase (EC 3.2.1.20)  yang mempunyai tingkat spesifik yang hamper sama dengan maltose. α–D-glukosida glukohidrolase (EC 3.2.1.20) dapat memecah sukrosa dari sisi cincin glukosidik oksigen glukosa dan β-D-fruktofuranoside hidrolase (EC 3.2.1.26) yang dapat menyerang sukrosa dari bagian ujung fruktosa. Bifidobacteria dalam yeast mempunyai enzim - fruktofuranosidase yang mampu memecah ikatan antar β-D-fruktofuranoside sehingga oligosakarida seperti sukrosa dapat dicerna dalam tubuh ( pada dasarnya oligosakarida tidak dapat dicerna, dihidrolisa dan diserap oleh usus halus ).

Praktikum ini terbagi kedalam 3 tahap yaitu persiapan bahan, hidrolisis sukrosa dan uji benedict. Tahap pertama, sebanyak 1 gram yeast dihaluskan kemudian ditambahkan denga larutan buffer pH 4,5 sebanyak 100 ml. Setelah itu, campuran disentrifuse selama 5 menit lalu diambil filtratnya.

Tahap kedua adalah hidrolisis sukrosa dengan - fruktofuranosidase. Kedalam tabung reaksi, dimasukkan sukrosa 0,3 M, akuades dan larutan buffer pH 4,5 secara bertahap sesuai dengan jumlah yang telah ditentukan pada table berikut:

Bahan	Kelompok 6	Kelompok 7	Kelompok 8	Kelompok 9	Kelompok 10
Sukrosa 0,3 M	10	8	6	4	2
Akuades	0	2	4	6	8
Buffer pH 4,5	6	6	6	6	6

Setelah penambahan larutan buffer pH 4,5, langkah selanjutnya adalah melakukan inkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 5 menit. Kemudian, ditambahkan 4 ml yeast 1% kedalam campuran lalu tabung kembali diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 6 menit. Setelah itu ditambahkan 2 ml larutan NaOH 1%.

Larutan yang dihasilkan pada tahap kedua disebut dengan larutan A. Setelah dilakukan tahap kedua, dilakukan pengujian benedict pada tahap ketiga. Uji benedict bertujuan untuk mengukur gula reduksi total atau glukosa yang dihasilkan. Larutan A dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan dengan 5 ml larutan benedict. Setelah itu, dipanaskan kembali pada suhu 96 ⁰C selama 2 menit. Ukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada 630 nm.

            Prinsip kerja spektrofotometer berdasarkan pada hukum Lambert Beer, yaitu bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitans adalah perbandingan intensitas cahaya yang ditransmisikan ketika melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati sampel (Io).

            Persyaratan hukum Lambert Beer, antara lain: radiasi yang digunakan harus monokromatik, energi radiasi yang diabsorpsi oleh sampel tidak menimbulkan reaksi kimia, sampel (larutan) yang mengabsorpsi harus homogen, tidak terjadi fluoresensi atau phosporesensi, dan indeks refraksi tidak berpengaruh terhadap konsentrasi, jadi larutan tidak pekat (harus encer).

            Pertama, masukkan kuvet berisi akuades terlebih dahulu kedalam spektrofotometer yang sudah dinyalakan selama 30 menit lalu atur transmisinya menjadi 100%. Setelah itu, masukkan kuvet yang telah berisi sampel kedalam spektrofotometer lalu baca transmisinya.

            Table 1. Hasil Praktikum

Sampel	Absorbansi	Konsentrasi Sukrosa (S)	V (A/t)	x (1/[S])	y (1/V)
I	3,76	0.15	0,0104	6,6667	95,745
II	3,02	0.12	8,3889x10-3	8,3333	119,205
III	2,96	0.09	8,222x10-3	11,111	121,622
IV	2,1	0.06	5,833x10-3	16,667	171,428
V	1,84	0.03	5,111x10-3	33,333	195,652

Berdasarkan regresi:

Nilai Intersep (B) = 3,529864

Nilai Slope (A) = 86,998

B = 1/V_max

3,529864 = 1/ V_max

V_max = 0,011494505

A = km/ V_max

86,998= km/0,011494505

Konstanta Michaelis = 0,040574045

            Pada uji benedict, campuran akan menghasilkan warna biru. Namun pada hasil praktikum, warna yang didapat adalah kuning pekat. Untuk mencegah tidak terbacanya absorbansi oleh spektrofotometer, maka dilakukan pengenceran dan menghasilkan warna hijau bening.

Enzim dalam jumlah yang sangat rendah akan mengakibatkan kecepatan reaksinya rendah. Namun dengan adanya peningkatan konsentrasi substrat, kecepatan reaksi akan meningkat hingga mencapai maksimum. Pada kecepatan maksimum, enzim akan menjadi jenuh oleh substratnya dan tidak akan berfungsi lebih cepat.

Konstanta Michaelis-Menten (K_m) merupakan suatu konsentrasi substrat tertentu yang menyebabkan kecepatan reaksi oleh katalis enzim menjadi ½ kecepatan maksimumnya (V_m). Persamaan Michaelis-Menten adalah pernyataan aljabar bagi bentuk hiperbolik kurva dengan parameter pentingnya yaitu konsentrasi substrat [S], kecepatan awal (V_o), Vmaks, dan K_M. Bentuk persamaan Michaelis-Menten adalah sebagai berikut :

                                    v_o  =   V_maks[S]

                                                K_M +[S]

Data diatas menunjukkan bahwa kerja enzim β-D-fruktofuranosidase akan meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat yaitu sukrosa. Semakin banyak jumlah substrat sukrosa dalam campuran, maka kecepatannya akan semakin cepat. Menurut Michaelis- Menten, harga Km sama dengan konsentrasi substrat (dalam mol perliter) yang menghasilkan kecepatan reaksi sebesar setengah dari kecepatan maksimum. Pada hasil praktikum, didapatkan bahwa nilai Km nya adalah 0,040574045. Apabila mengikuti hukum Michaelis- Menten, didapatkan kecepatan maksimumnya adalah 0,08114809. Ketika kecepatannya melebihi 0,08114809, kecepatan reaksi akan menurun hingga enzim β-D-fruktofuranosidase akan jenuh terhadap sukrosa. Sehingga kecepatan reaksinya cenderung tidak akan meningkat.

VI.       KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang sudah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa nilai konstanta Michaelis yang dihasilkan pada praktikum adalah 0,040574045. Sehingga didapatkan kecepatan reaksi maksimumnya adalah 0,08114809.  Apabila kecepatannya melebihi 0,08114809, kecepatan reaksi akan menurun hingga enzim β-D-fruktofuranosidase akan jenuh terhadap sukrosa. Sehingga kecepatan reaksinya cenderung tidak akan meningkat.

DAFTAR PUSTAKA

Deman, John M. 1997. Kimia Makanan. Edisi kedua. Penerjemah : Prof. Dr. Kosasih Padmawinata. Bandung : ITB

Hadi Anim. 2009. Spektrofotometri. Available at : http://tjahkimiaunnes.blogspot.com ( diakses pada 19 November 2011).

Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Penerjemah : Dr. Ir. Maggy Thenawidjaja. Erlangga. Jakarta.

Manning TS et. al. 2004. Prebiotik. Best Practice and Research Gastroenterology

Poedjiadi, Ana. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI-press