konstanta michaelis

V.        HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Enzim merupakan biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis ( senyawa yang dapat mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia organic. Enzim bekerja dengan cara bereaksi dengan molekul substrat untuk menghasilkan senayawa intermediet melalui suatu reaksi kimia organic yang membutuhkan energy aktivasi lebih rendah sehingga reaksi kimia mengalami percepatan reaksi.

Kerja dari suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa factor diantaranya adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan inhibitor. Suhu dan pH yang terlalu ekstrim ( diluar kondisi optimum), enzim akan mengalami perubahan bentuk karena denaturasi. Hal tersebut akan menyebabkan enzim kehilangan fungsinya. Selain dengan suhu dan pH, kerja enzim juga dipengaruhi oleh kandungan substratnya. Namun hubungan antara substrat dan enzim hanya terjadi pada bagian tertentu. Tempat atau bagian enzim yang mengadakan hubungan atau kontak dengan substrat disebut dengan bagian aktif ( active site ). Bagian aktif atau sisi aktif sering disebut juga dengan nama sisi katalitik atau sisi pengikatan substrat. Hubungan antara enzim dengan substratnya terbagi menjadi dua model yaitu:

1.      Moel kunci dan gembok ( Lock And Key )

2.      Model Induced- fit.

Enzim berdasarkan jenisnya terbagi menjadi 6 golongan yaitu:

1.      Oksidoreduktase

2.      Transferase

3.      Hidrolase

4.      Liase

5.      Isomerase

6.      Ligase

Michaelis dan Menten berkesimpulan bahwa kecepatan reaksi tergantung pada konsentrasi kompleks enzim-substrat (ES), sebab apabila tergantung pada konsentrasi substrat (s), maka penambahan kecepatan reaksi apabila digambarkan akan merupakan garis lurus. Sehingga reaksi dengan enzim ditulis sebagai berikut:

K1       = tetapan kecepatan reaksi pembentukan kompleks ES

K2       =  tetapan (konstanta) kecepatan reaksi pembentukan kembali E dan S

K3         = tetapan (konstanta) kecepatan reaksi penguraian kompleks ES menjadi enzim dan hasil reaksi

Pada praktikum kali ini, akan dilakukan penentuan konstanta Michaelis pada hidrolisis sukrosa oleh - fruktofuranosidase dari yeast.

Oligosakarida merupakan gula dengan 3 hingga 20 unit sakarida. Oligosakarida merupakan rantai pendek polisakarida ( Manning et al. 2004 ). Karakteristik senyawa oligosakarida menurut Manning dan Gibson ( 2004) adalah sebagai berikut:

1.      Tersusun atas dua monosakarida.

2.      Memiliki ikatan glikosidik.

3.      Memiliki berat molekul yag lebih rendah dibandingkan dengan polisakarida.

Sukrosa merupakan salah satu jenis oligosakarida. Sukrosa merupakan gula meja yang pada umumnya dihasilkan oleh tumbuhan terutama pada tumbuhan tebu. Sukrosa apabila dihidrolisis maka akan menghasilkan α-Glukosa dan β-Fruktosa. Berikut adalah gambar struktur dari sukrosa:

Sukrosa mengalami invertase dari α–D-glukosida glukohidrolase (EC 3.2.1.20)  yang mempunyai tingkat spesifik yang hamper sama dengan maltose. α–D-glukosida glukohidrolase (EC 3.2.1.20) dapat memecah sukrosa dari sisi cincin glukosidik oksigen glukosa dan β-D-fruktofuranoside hidrolase (EC 3.2.1.26) yang dapat menyerang sukrosa dari bagian ujung fruktosa. Bifidobacteria dalam yeast mempunyai enzim - fruktofuranosidase yang mampu memecah ikatan antar β-D-fruktofuranoside sehingga oligosakarida seperti sukrosa dapat dicerna dalam tubuh ( pada dasarnya oligosakarida tidak dapat dicerna, dihidrolisa dan diserap oleh usus halus ).

Praktikum ini terbagi kedalam 3 tahap yaitu persiapan bahan, hidrolisis sukrosa dan uji benedict. Tahap pertama, sebanyak 1 gram yeast dihaluskan kemudian ditambahkan denga larutan buffer pH 4,5 sebanyak 100 ml. Setelah itu, campuran disentrifuse selama 5 menit lalu diambil filtratnya.

Tahap kedua adalah hidrolisis sukrosa dengan - fruktofuranosidase. Kedalam tabung reaksi, dimasukkan sukrosa 0,3 M, akuades dan larutan buffer pH 4,5 secara bertahap sesuai dengan jumlah yang telah ditentukan pada table berikut:

Bahan	Kelompok 6	Kelompok 7	Kelompok 8	Kelompok 9	Kelompok 10
Sukrosa 0,3 M	10	8	6	4	2
Akuades	0	2	4	6	8
Buffer pH 4,5	6	6	6	6	6

Setelah penambahan larutan buffer pH 4,5, langkah selanjutnya adalah melakukan inkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 5 menit. Kemudian, ditambahkan 4 ml yeast 1% kedalam campuran lalu tabung kembali diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 6 menit. Setelah itu ditambahkan 2 ml larutan NaOH 1%.

Larutan yang dihasilkan pada tahap kedua disebut dengan larutan A. Setelah dilakukan tahap kedua, dilakukan pengujian benedict pada tahap ketiga. Uji benedict bertujuan untuk mengukur gula reduksi total atau glukosa yang dihasilkan. Larutan A dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan dengan 5 ml larutan benedict. Setelah itu, dipanaskan kembali pada suhu 96 ⁰C selama 2 menit. Ukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada 630 nm.

            Prinsip kerja spektrofotometer berdasarkan pada hukum Lambert Beer, yaitu bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitans adalah perbandingan intensitas cahaya yang ditransmisikan ketika melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati sampel (Io).

            Persyaratan hukum Lambert Beer, antara lain: radiasi yang digunakan harus monokromatik, energi radiasi yang diabsorpsi oleh sampel tidak menimbulkan reaksi kimia, sampel (larutan) yang mengabsorpsi harus homogen, tidak terjadi fluoresensi atau phosporesensi, dan indeks refraksi tidak berpengaruh terhadap konsentrasi, jadi larutan tidak pekat (harus encer).

            Pertama, masukkan kuvet berisi akuades terlebih dahulu kedalam spektrofotometer yang sudah dinyalakan selama 30 menit lalu atur transmisinya menjadi 100%. Setelah itu, masukkan kuvet yang telah berisi sampel kedalam spektrofotometer lalu baca transmisinya.

            Table 1. Hasil Praktikum

Sampel	Absorbansi	Konsentrasi Sukrosa (S)	V (A/t)	x (1/[S])	y (1/V)
I	3,76	0.15	0,0104	6,6667	95,745
II	3,02	0.12	8,3889x10-3	8,3333	119,205
III	2,96	0.09	8,222x10-3	11,111	121,622
IV	2,1	0.06	5,833x10-3	16,667	171,428
V	1,84	0.03	5,111x10-3	33,333	195,652

Berdasarkan regresi:

Nilai Intersep (B) = 3,529864

Nilai Slope (A) = 86,998

B = 1/V_max

3,529864 = 1/ V_max

V_max = 0,011494505

A = km/ V_max

86,998= km/0,011494505

Konstanta Michaelis = 0,040574045

            Pada uji benedict, campuran akan menghasilkan warna biru. Namun pada hasil praktikum, warna yang didapat adalah kuning pekat. Untuk mencegah tidak terbacanya absorbansi oleh spektrofotometer, maka dilakukan pengenceran dan menghasilkan warna hijau bening.

Enzim dalam jumlah yang sangat rendah akan mengakibatkan kecepatan reaksinya rendah. Namun dengan adanya peningkatan konsentrasi substrat, kecepatan reaksi akan meningkat hingga mencapai maksimum. Pada kecepatan maksimum, enzim akan menjadi jenuh oleh substratnya dan tidak akan berfungsi lebih cepat.

Konstanta Michaelis-Menten (K_m) merupakan suatu konsentrasi substrat tertentu yang menyebabkan kecepatan reaksi oleh katalis enzim menjadi ½ kecepatan maksimumnya (V_m). Persamaan Michaelis-Menten adalah pernyataan aljabar bagi bentuk hiperbolik kurva dengan parameter pentingnya yaitu konsentrasi substrat [S], kecepatan awal (V_o), Vmaks, dan K_M. Bentuk persamaan Michaelis-Menten adalah sebagai berikut :

                                    v_o  =   V_maks[S]

                                                K_M +[S]

Data diatas menunjukkan bahwa kerja enzim β-D-fruktofuranosidase akan meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat yaitu sukrosa. Semakin banyak jumlah substrat sukrosa dalam campuran, maka kecepatannya akan semakin cepat. Menurut Michaelis- Menten, harga Km sama dengan konsentrasi substrat (dalam mol perliter) yang menghasilkan kecepatan reaksi sebesar setengah dari kecepatan maksimum. Pada hasil praktikum, didapatkan bahwa nilai Km nya adalah 0,040574045. Apabila mengikuti hukum Michaelis- Menten, didapatkan kecepatan maksimumnya adalah 0,08114809. Ketika kecepatannya melebihi 0,08114809, kecepatan reaksi akan menurun hingga enzim β-D-fruktofuranosidase akan jenuh terhadap sukrosa. Sehingga kecepatan reaksinya cenderung tidak akan meningkat.

VI.       KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang sudah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa nilai konstanta Michaelis yang dihasilkan pada praktikum adalah 0,040574045. Sehingga didapatkan kecepatan reaksi maksimumnya adalah 0,08114809.  Apabila kecepatannya melebihi 0,08114809, kecepatan reaksi akan menurun hingga enzim β-D-fruktofuranosidase akan jenuh terhadap sukrosa. Sehingga kecepatan reaksinya cenderung tidak akan meningkat.

DAFTAR PUSTAKA

Deman, John M. 1997. Kimia Makanan. Edisi kedua. Penerjemah : Prof. Dr. Kosasih Padmawinata. Bandung : ITB

Hadi Anim. 2009. Spektrofotometri. Available at : http://tjahkimiaunnes.blogspot.com ( diakses pada 19 November 2011).

Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Penerjemah : Dr. Ir. Maggy Thenawidjaja. Erlangga. Jakarta.

Manning TS et. al. 2004. Prebiotik. Best Practice and Research Gastroenterology

Poedjiadi, Ana. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI-press

reaksi enzimatis

V.        HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Enzim merupakan salah satu komponen alami yang terdapat pada sayur maupun buah yang mana didalamnya tersusun atas beberapa gugus polipeptida ( protein ). Gugus polipeptida atau protein berfungsi sebagai katalisator atau senyawa yang mempercepat reaksi kimia tanpa ikut bereaksi. Enzim bekerja pada suatu reaksi dengan cara menempel pada permukaan molekul zat- zat yang akan bereaksi dan dengan demikian keberadaannya akan mempercepat reaksi yang terjadi. Percepatan akan terjadi karena enzim menurunkan energy pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah terjadinya reaksi. Pada sebagian enzim akan bekerja secara khas berganting pada reaksi dimana enzim tersebut berada. Hal tersebut kemungkinan disebabkan oleh perbedaan struktur kimia tiap enzim- enzim yang bersifat tetap.

Kerja dari suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa factor diantaranya adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan inhibitor. Suhu dan pH yang terlalu ekstrim ( diluar kondisi optimum), enzim akan mengalami perubahan bentuk karena denaturasi. Hal tersebut akan menyebabkan enzim kehilangan fungsinya.

Setiap enzim memiliki bagian- bagian tertentu yang memiliki nama berbeda pula. Enzim lengkap disebut juga dengan holoenzim, bagian protein dari enzim dinamakan dengan apoenzim sedangkan bagian non protein dari enzim dinamakan dengan kofaktor. Senyawa- senyawa yang dapat dirubah pada suatu reaksi kimia yang dikatalis oleh enzim disebut dengan substrat ( deMan, 1997 ).

Kerja enzim sangat dipengaruhi oleh suhu. Enzim katalase yang bersifat tahan pada suhu tinggi atau panas ( heat- resistant ) dalam buah- buahan dan sayur- sayuran dapat menimbulkan perubahan yang tidak dikehendaki selama proses penyimpanan. Agar perubahan- perubahan yang tidak diinginkan tersebut tidak terjadi, maka perlu dilakukan proses penekanan terhadap aktivitas enzim tersebut. Beberapa cara dapat dilakukan untuk menghambat aktivitas enzim tersebut. Salah satu caranya adalah melakukan blansing sebelum dilakukan pengolahan lanjutan.

Pada praktikum kali ini, akan dilakukan pengujian mengenai pengaruh beberapa perlakuan pemanasan terhadap aktivitas enzim dan sifat organoleptik dari sayur- sayuran. Pada praktikum kali ini, hanya dilakukan pengujian aktivitas enzim peroksidase saja. Enzim peroksidase adalah salah satu enzim yang bersifat tahan panas dalam sayur- sayuran. Perlakuan pemanasan yang dilakukan ada dua yaitu blansing dengan cara dikukus dan blansing dengan cara direbus. Untuk pengolahan blansing dengan cara dikukus, pertama dipanaskan air dalam dandang hingga suhunya mencapai 100 ⁰C. kemudian dimasukkan sampel yang telah dipotong bulat kedalam dandang lalu ditutup dengan menggunakan penutup selama 15 menit. Setelah 15 menit, sampel diangkat dan dimasukkan kedalam es selama 3 menit lalu tiriskan.

Sedangkan untuk perlakuan blansing dengan cara direbus, langkah pertama yang harus dilakukan adalah memanaskan air didalam panci hingga suhunya mencapai 87 ⁰C. Kemudian sampel yang sudah dipotong bulat- bulat dimasukkan kedalam panci lalu ditutup dengan lama waktu yang berbeda yaitu 0,5 menit, 2,5 menit dan 7,0 menit. Setelah lama waktu tercapai, dimasukkan sampel kedalam es selama 3 menit lalu ditiriskan. Untuk pembanding ( control ), sayur- sayuran dipotong namun tanpa diberi perlakuan pemanasan sama sekali.

Kemudian hasil pemanasan maupun control, dilakukan uji lanjutan berupa pengujian peroksidase. Sampel ditimbang lalu ditambahkan dengan 30 ml akuades kedalam beaker glass. Setelah itu, diambil filtratnya sebanyak 2 ml kedalam tabung reaksi. Ditambahkan kembali dengan 20 ml akuades lalu kocok. Lalu ditambahkan lagi dengan 1 ml larutan gualkol 0,5 % dan 1 ml larutan H₂O₂ 0,02 % lalu didiamkan selama 3,5 menit. Bandingkan sifat organoleptik hasil dengan blanko.

Table 1. Sifat Organoleptik Sampel Terong

	Tanpa Perlakuan	Blansing Cara Didih			Blansing Cara Kukus
		t= 0,5 menit	t= 2,5 menit	t= 7 menit	t = 3 menit
Warna	Hijau keputihan	Hijau kecoklatan	Hijau kecoklatan	Hijau pucat	Hijau tua kecoklatan
Aroma	Khas terong	Khas terong	Kas terong rebus	Khas terong	Khas terong
Tekstur	Keras ++	Lembek +++	Lunak ++++	Lembut +++	Lembut +++
Uji peroksida	Coklat ++++	Coklat ++	Coklat muda	Coklat bening	Coklat +++

Table 2. Sifat Organoleptik Sampel Buncis

	Tanpa Perlakuan	Blansing Cara Didih			Blansing Cara Kukus
		t= 1 menit	t= 3menit	t= 9menit	t = 1,5 menit
Warna	Hijau muda	Hijau tua ++	Hijau tua ++	Hijau tua +	Hijau tua +++
Aroma	Buncis segar ++	Buncis segar +	Buncis matang ++	Buncis matang +++	Buncis matang +
Tekstur	Keras +++++	Keras ++++	Keras +++	Keras +	Keras ++
Uji peroksida	Coklat +++++	Coklat +++	Coklat ++	Coklat +	Coklat ++++

Table 3. Sifat Organoleptik Sampel Tomat

	Tanpa Perlakuan	Blansing Cara Didih			Blansing Cara Kukus
		t= 0,5 menit	t= 1,5 menit	t= 5 menit	t = 3 menit
Warna	Merah ++++	Merah +++++	Merah ++	Merah +++	Merah +
Aroma	Khas tomat +++++	Khas tomat ++++	Khas tomat +++	Khas tomat +	Khas tomat ++
Tekstur	Lunak +	Lunak ++	Lunak +++	Lunak +++++	Lunak ++++
Uji peroksida	Merah +	Merah +++++	Merah ++++	Merah +++++	Merah ++coklat

Table 4. Sifat Organoleptik Sampel Kubis

	Tanpa Perlakuan	Blansing Cara Didih			Blansing Cara Kukus
		t= 0,5 menit	t= 1,5 menit	t= 5 menit	t = 3 menit
Warna	Putih kehijauan	Putih kehijauan ++++	Hijau cerah ++	Hijau cerah +	Hijau muda
Aroma	Khas kubis +++	Khas kubis ++++	Beraroma +++	Beraroma +++	Beraroma +
Tekstur	Keras +++, berlubang	Keras ++	Beraroma +++++	Lebih lunak ++++	Lebih licin
Uji peroksida	Coklat ++++	Coklat +	Bening +++	Bening ++	Bening +

Enzim peroksidase apabila dikombinasi dengan glukosa peroksidase, maka enzim tersebut dapat menyebabkan terjadinya pencokelatan. Enzim peroksidase dapat diketahui melalu pemberian larutan H₂O₂ 0,02 %. Apabila dalam suatu sampel mengandung enzim peroksidase yang kemudian bereaksi dengan larutan tersebut maka akan dihasilkan perubahan warna merah kecokelatan. Menurut literature, perlakuan pemanasan dapat menghambat aktivitas dari enzim peroksidase. Semakin lama waktu pemanasan yang dilakukan, maka penonaktifan kerja enzim akan semakin sempurna.

Berdasarkan table 1, didapatkan bahwa perlakuan blansing cara didih selama 7 menit aktivitas dari enzim peroksidase sampel terong sudah dapat dihambat. Hal tersebut dapat dilihat dari adanya perubahan warna antara blanko serta waktu pemanasan lainnya. Apabila terong diblansing melebihi 7 menit, maka enzim peroksidase pada terong sudah terhambat secara sempurna. Sedangkan perlakuan blansing cara kukus terhadap terong dianggap kurang efektif karena perubahan warna yang terjadi antara blanko dan sampel kukus tidak berbeda terlalu jauh.

Pada table 2, didapatkan bahwa perlakuan blansing cara didih selama 3 menit sudah mulai dapat menghambat aktivitas dari enzim peroksidase. Apabila pemanasan terus dilakukan hingga lebih dari 9 menit, kemungkinan yang terjadi adalah aktivitas enzim dapat dihambat secara sempurna. Sedangkan pada perlakuan blansing kukus selama 1,5 menit dianggap kurang efektif dalam menghambat aktivitas enzim.

Pada table 3, didapatkan bahwa semakin lama dilakukan blansing didih maka warnanya akan semakin memekat. Hal tersebut merupakan salah satu kesalahan yang mungkin disebabkan oleh praktikan dalam melakukan prosedur praktikum.

Pada table 4, didapatkan bahwa aktivitas enzim peroksidase sudah dapat dihambat pada blansing menit ke 1,5. Sehingga blansing kukus yang dilakukan selama 3 menit sudah dipastikan dapat menhambat aktivitas enzim peroksidase secara sempurna.

Apabila membandingkan ketahanan enzim peroksidase terhadap perubahan yang terjadi saat waktu pemanasan terlama dari ketiga sampel tersebut ( sampel tomat dianggap sebagai kesalahan ), maka didapatkan urutan sebagai berikut ( yang paling tahan à tidak tahan panas ):

Buncis à Terong à Kubis

Blansing ( baik kukus maupun didih ) selain dapat menyebabkan perubahan aktivitas enzim juga dapat menyebabkan perubahan sifat- sifat organoleptik. Semakin lama sampel diblansing, maka enzim pewarna alaminya akan terlarut kedalam air sebagian sehingga warnanya berubah menjadi lebih pucat. Sedangkan dari segi tekstur, kemampuan sel- sel sampel yang mampu merangkap air dapat menyebabkan kandungan air dalam sampel menjadi lebih banyak. Jumlah air yang terlalu banyak dapat menyebabkan teksturnya menjadi melembut hingga melunak.

Sampel yang terlalu lama diblansing juga dapat menyebabkan berkurangnya zat aroma dalam sampel. Karena sebagian dari zat aroma tersebut menguap. Apabila ditinjau dari segi gizinya, sayuran yang terlalu lama diblansing dapat mengalami penurunan kualitas karena banyaknya zat gizi yang dapat menguap pada suhu tinggi.

VI.       KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang sudah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa blansing dapat menghambat aktivitas enzim peroksidase. Semakin lama waktu blansing, maka penghambatan aktivitas enzim akan semakin sempurna. Namun blansing yang terlalu lama dapat menyebabkan perubahan lain seperti penurunan intensitas warna, penuruna ketajaman aroma dan penurunan tingkat kekerasan sampel. Apabila ditinjau dari segi gizi, blansing terlalu lama dapat menyebabkan penurunan nilai gizi.

DAFTAR PUSTAKA

Buckle, K.A., Edwards, R.A., Fleet, G.H., Wooton, M. 1987. Ilmu Pangan. Universitas Indonesia Press: Jakarta.

Herudiyanto, Marlen S. 2006. Pengantar Teknologi Pengolahan Pangan. Penerbit : Widya Padjajaran: Bandung.

Man, J. M, de. 1997. Kimia Makanan Edisi Kedua. Penerbit ITB: Bandung.

Tjahjadi, Carmencita. 2008. Pengantar Teknologi Pangan (Volume I). Jurusan Teknologi Industri Pangan. Fakultas Teknologi Industri Pertanian. Universitas Padjajaran: Jatinangor.

Winarno, F.G. 1982. Kimia Pangan dan Gizi. Penerbit : PT Gramedia Pustaka Utama : Jakarta.